En este proyecto se pretende desarrollar un metodo para detectar la presencia en la leche de esporos de los clostridios causantes de la fermentacion butirica en los quesos. Esta alteracion se produce en quesos de pasta dura y semidura a los dos o tres meses de maduracion y se conoce como hinchazon tardia. Uno de los problemas comunes a todos los metodos que se han desarrollado para la deteccion de los esporos es su falta de sensibilidad, ya que tan solo 100 esporos por litro de leche pueden causar problemas de hinchazon en los quesos, nivel que no llegan a detectar los procedimientos actuales o no lo detectan con suficiente precision y fiabilidad. Los metodos utilizados para detectar los esporos de clostridios butiricos son de tipo microbiologico y requieren de un largo periodo de incubacion, por lo que no son utiles cuando la industria tiene que decidir el destino de una partida de leche. En este proyecto se plantea el desarrollo de un metodo en dos etapas: la primera, una separacion y concentracion de los esporos presentes en la leche mediante particulas magneticas funcionalizadas con ligandos especificos por los esporos, y la segunda, que consiste en su deteccion y cuantificacion por pcr o citometria de flujo. Para la funcionalizacion de las particulas magneticas con ligandos se utilizara una doble aproximacion, en la primera, se utilizaran anticuerpos especificos frente a los esporos de las especies de clostridios butiricos. En la segunda, se utilizara un peptido afin por dichos esporos, obtenido por la tecnica de phage display o seleccion a partir de una biblioteca de peptidos expresados en fagos. En esta segunda aproximacion, se plantea utilizar la estrategia de clonar la proteina gpiii del fago m13 junto con el peptido especifico para funcionalizar las particulas magneticas con la proteina clonada, favoreciendo asi la interaccion del peptido con los esporos. Una vez separados y concentrados los esporos por la tecnica biomagnetica que aporte los mejores resultados, se procedera a cuantificar el nivel de esporos por una pcr, o por citometria de flujo. En el primer caso, se utilizara una pcr convencional semianidada en dos etapas y con tres cebadores para incrementar el limite de deteccion, o bien una pcr isotermica. En el segundo caso, se utilizaran como marcadores de los esporos los anticuerpos especificos o el peptido marcados con un fluoroforo. En la fase final, se transferira la tecnologia que haya dado mejores resultados, a una empresa de biotecnologia para que desarrolle un prototipo que se ensayara y validara con muestras reales de leche de vaca, oveja y cabra, contaminadas con esporos de clostridios butiricos y suministradas por laboratorios interprofesionales lecheros. La existencia de un test que permita cuantificar el nivel de esporos de clostridios butiricos en leche permitira a las industrias queseras conocer la calidad de la leche en cuanto al nivel de esporos de clostridios butiricos y favorecer la mejora en las practicas higienicas de los productores. La calidad de los quesos elaborados con leche libre de esporos aumentara, al convertirse en productos sin aditivos, ya que actualmente los que mas se utilizan para prevenir la fermentacion butirica son la lisozima, una proteina alergenica de huevo, y los nitratos y nitritos, que pueden generar nitrosaminas potencialmente cancerigenas. Ademas, obtener lactosuero de queseria libre de nitratos seria mas seguro para destinarlo a un uso como ingrediente alimentario.